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使相机与显微镜分辨率匹配
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北京澳门新萄京最大平台科技

时间 : 2020-12-31 16:39 浏览量 : 2

   电荷耦合器件(CCD)或互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器的最终分辨率取决于光电二极管的数量及其尺寸(相对于显微镜光学系统投射到成像阵列表面的图像的相对尺寸) 。当尝试使显微镜的光学分辨率与特定的数码相机和视频耦合器组合匹配时,请使用此计算器来确定从显微镜充分捕获所有光学数据所需的最小像素密度。

   

   本教程使用出现在“标本图像” 窗口(黑匣子)中的随机选择的标本进行初始化,并以目镜孔径或投影透镜视场光阑为界。指定CCD尺寸(默认为2/3英寸)的彩色矩形叠加在图像上,以显示传感器捕获的样本的实际区域。在滑块下方的灰色,黄色和红色框中,显微镜的光学分辨率(灰色),CCD所需的像素大小(黄色),最佳CCD阵列大小(黄色),显示器放大倍数(红色)和总放大倍数图像的(红色)以微米或产品表示。这些值在平移滑块时不断更新。可以使用“样本图像”窗口左侧出现的单选按钮来选择新的CCD格式(尺寸)。所选传感器的物理CCD尺寸(以毫米为单位)沿着与显示芯片具有相同长宽比的矩形显示在图像窗口的右侧。

   为了操作本教程,请移动“数值孔径”和“物镜放大率”滑块(值显示在滑块上方),以设置要考虑的显微镜光学配置的适当值。接下来,选择一个目镜或投影透镜场编号(值范围在18到26毫米之间)和视频耦合器放大倍数(在0.5x到1.0x之间)。平移耦合器滑块时,教程会更改叠加在样本图像上的矩形的大小,以匹配CCD传感器捕获的样本区域。使用“选择标本”下拉菜单可以随时选择一个新标本 。

   将光学显微镜产生的图像捕获到CCD或CMOS图像传感器的光电二极管阵列上的效率取决于几个因素,从物镜放大倍率,数值孔径和分辨率到电子图像传感器光电二极管阵列的大小,纵横比,视频耦合器放大倍数以及阵列中各个感光元件的尺寸。此外,还必须考虑特定于所成像样本的参数,例如对比度,信噪比,场景内动态范围和积分时间。

   CCD的最终光学分辨率取决于光电二极管的数量及其尺寸(相对于显微镜透镜系统投射到阵列表面的图像的大小)的函数。当前可用的CCD阵列的大小从几百个像素到数千个像素不等。用于科研的设备中使用的现代阵列尺寸范围从1000×1000到5000×5000传感器元件。消费级和科学级CCD的发展趋势是传感器尺寸不断减小,目前可使用的光电二极管小至4×4微米。

   用显微镜的光学元件成像的标本的足够分辨率只有在每个可分辨单元至少制作两个样本的情况下才能实现,尽管许多研究人员更喜欢每个可分辨单元三个样本以确保足够的采样。在诸如显微镜的衍射受限光学仪器中,当使用数值孔径为1.4的物镜时,在平均可见光波长(550纳米)处的光学分辨率的阿贝极限为0.20微米。在这种情况下,10平方微米的传感器尺寸恰好足够大以允许光学和电子分辨率匹配,首选7×7微米的传感器尺寸。尽管CCD图像传感器中较小的光电二极管可以改善空间分辨率,但它们也限制了器件的动态范围。

   

    表1-匹配显微镜光学分辨率的像素大小要求

物镜
(数值孔径)
分辨率
极限
(微米)
投影
尺寸
(微米)
所需像素
大小
(微米)
1倍(0.04)6.96.93.5
2倍(0.06)4.69.24.6
2倍(0.10)2.85.62.8
4倍(0.10)2.811.25.6
4倍(0.12)2.39.24.6
4倍(0.20)1.45.62.8
10倍(0.25)1.111.05.5
10倍(0.30)0.929.24.6
10倍(0.45)0.616.13.0
20倍(0.40)0.6913.86.9
20倍(0.50)0.5511.05.5
20倍(0.75)0.377.43.7
40倍(0.65)0.4216.88.4
40倍(0.75)0.3714.87.4
40倍(0.95)0.2911.65.8
40倍(1.00)0.2811.25.6
40倍(1.30)0.218.44.2
60倍(0.80)0.3420.410.2
60倍(0.85)0.3219.29.6
60倍(0.95)0.2917.48.7
60倍(1.40)0.2012.06.0
100倍(0.90)0.3131.015.5
100倍(1.25)0.2222.011.0
100倍(1.30)0.2121.010.5
100倍(1.40)0.2020.010.0

   

   在显微镜下,图像通常由光学系统投影到检测器的表面上,该检测器可以是人眼的视网膜,电图像传感器或传统胶片上的敏感化学乳剂。为了优化所得图像的信息内容,检测器的分辨率必须与显微镜的分辨率紧密匹配。用于产生样本图像的可见光的波长光谱是相对于光学分辨率而言显微镜性能的决定因素之一。与较长的波长(大于500纳米)相比,较短的波长(375-500纳米)能够更大程度地解析细节。空间分辨率的极限还取决于通过光学系统的光的衍射,该术语通常称为衍射极限分辨率。研究人员推导出了几个方程,这些方程已被用来表达数值孔径,波长和光学分辨率之间的关系:

   

   

   

   

   

   

   

   其中r是分辨率(两个样本点之间的最小可分辨距离),NA等于物镜数值孔径,λ等于波长,NA(Obj)等于物镜数值孔径,而NA(Cond)是聚光镜数值孔径。注意,方程(1)和(2)由所述乘法因子,这是0.5方程不同(1)和0.61方程(2)。这些方程式基于许多因素,包括光学物理学家为解决物镜和聚光镜的行为而进行的各种理论计算,不应视为任喊拿判绿丫┳畲笃教ɑ项一般物理定律的绝对值。假设当其中一个光源产生的艾里叶圆盘的中心与第二艾里叶圆盘的衍射图中的一阶反射重叠时,可以分辨(单独成像)两个点光源,这种条件称为瑞利标准。在某些情况下,例如共聚焦和多光子荧光显微镜,分辨率实际上可能超过了这三个方程式中的任喊拿判绿丫┳畲笃教ɑ个所设定的极限。其他因素(例如较低的样品对比度和不适当的照明)可能会降低分辨率,并且往往会降低r的实际最大值(使用550纳米的中光谱波长,约为0.20微米)和数值孔径在实践中无法实现1.35至1.40的系数。

   徕卡显微镜完全对准并且物镜与载物台下聚光镜适当匹配时,可以将物镜的数值孔径值代入方程式(1)和(2),将方程式(3)简化为方程式(2) )。需要注意的重要概念是,在任何这些方程式中,放大率都不是一个因素,因为只有数值孔径和照明波长决定了样品的分辨率。如上所述(可以在方程式中观察到),光的波长是显微镜分辨率的重要因素。较短的波长产生较高的分辨率(r的较低值),反之亦然。光学显微镜中最大的分辨力是通过近紫外光实现的,这是最短的有效成像波长。近紫外光之后是蓝色,然后是绿色,最后是红色,可以分辨出样品的细节。在大多数情况下,显微镜学家使用钨卤素灯泡产生的广谱白光照射样品。可见光谱的中心位于约550纳米,这是绿光的主要波长(澳门新萄京最大平台的眼睛对绿光最敏感)。表1给出了用于计算本教程的分辨率值的波长。数值孔径值在这些方程式中也很重要,数值孔径越高,分辨率也越高(请参见表1)。

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