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荧光显微镜原理
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北京澳门新萄京最大平台科技

时间 : 2021-01-29 23:58 浏览量 : 14

    一、荧光


    普通光是由发光体质点的热运动所引起的辐射;而荧光是非温度辐射,是一种冷光。荧光有多种,如光化荧光(由光源激发而产生的荧光),放射出荧光(由放射性物质激发而产生的荧光)。生物荧光(如磷的氧化时发出的荧光),等等。而荧光显微镜则是利用光化荧光这原理设计制造,达到荧光显微术镜检的目的,这个也是其工作原理。


    由于荧光显微镜的光源是利用人眼不可见的短波光,因而就大大提高了物镜的分辨率,图像与背景的反差亦甚为明显。


    二、荧光现象的原理


    将荧光物体放到光谱中的各色区域,就可发现引起荧光最有效的光线是光谱上波长较短的区域,即近紫外线区域,波长约为320-400nm。这种现象的实质是分子吸收了短光的能量(波长越短,光能越强),又以发光的形式以波长较长和荧光射出,而为人眼可见,这就是荧光现象。荧光接近可见光的红光端,大部分的荧光现象是符合这一规律的。


    荧光现象可分为两种:


    1.第一次荧光现象;又称固有荧光或自发荧光,当经紫外线的照射后,就能发出荧光的物质;


    2.第二次荧光现象:又称激发荧光,当经紫外线照射后不能或只部分发生微弱的荧光,这样就需先用荧光素处理,再经紫外线照射才能发生荧光,这是因组织内吸附或溶解有荧光素的缘故。


    三、荧光显微镜的原理


    滤色块是荧光显微镜的重要部位,其核心部件由激发光滤色片(firstbarrierfilter)、发射光滤色片(secondbarrierfilter)和半透半反滤色片(beam-splittingmirror)组成。


    1.激发光滤色片及发射光滤色片:根据光源和荧光色素的特点,通常选用以下三类配套,提供一定波长范围的激发光,并使样品激发出的荧光透过,到达目镜成像,此为其成像的原理。


    紫外光激发:激发光滤色片可使紫外光透过,阻挡400nm以上的可见光通过。与之相应的发射光滤色片可允许蓝光通过,视野内的光呈蓝色,如应用于DAPI染色。


    蓝光激发:激发光滤色片可使蓝光通过,阻挡其他波段的光。与之相应的发射光滤色片可允许绿光通过,如GFP染色标记。


    绿光激发:激发光滤色片使绿光通过,阻挡其他波段的光。与之相应的发射光滤色片通常可允许红光通过,如Rhodamine染色。


    2.半透半反滤色片:它的作用是完全阻挡激发光通过,而将其反射;并透过相应波长范围的发射光。其型号与激发光滤色片和发射光滤色片相对应。


    3.光路:光线在荧光滤色块中的传播光路为:反射光滤光片只允许光源中特定波长的光线透过,这部分激发光到达半透半返滤色片时被反射后通过物镜照射到样品上,样品中的荧光基团被激发光激发,发射出长波长的荧光;发射光通过物镜,透过半透半反滤色片,到达发射光滤色片,此时又只有特定波长的光线透过,通过目镜被澳门新萄京最大平台肉眼看到的就是样品中的荧光了。


    荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源,经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后,再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下,即使荧光很微弱也易辨认,敏感性高,主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究,这个是其工作原理。


    下图是荧光显微镜的光学系统原理图。由汞灯发出的各种谱线的光线,经激发滤光片后只让某一种波长的紫外光线通过,如波长为404.7nm蓝紫光,经反光镜后,激发样品产生荧光。激发滤光片将其他波长的光线滤掉,并使样品激发荧光,所以称其为激发滤光片。通常,激发产生的荧光波长比激发样品的光的波长大得多,是可见光。这样产生的荧光和透过样品的一部分激发光(紫外光),经物镜成像后,人眼即可用目镜观察荧光图像。为了防止紫外光进入目镜视场,降低图像衬度和损伤人眼,放置了一块截止滤光片,它只让某一部分波长的谱线通过,如只让500~750nm的可见光通过,而不让500nm以下的光通过。


    荧光显微镜原理


    从图中可以看出,光源是荧光显微镜主要组成部分,荧光显微镜都采用200W的超高压汞灯作光源。它是由石英玻璃制作,中间呈球形,内充有一定量的汞,工作时在两极间放电,引起水银蒸发,球内气压迅速升高,当水银完全蒸发时,可达50~70个标准大气压力,这一过程一般约5~15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子在不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫光,足以激发各类荧光物质,因此被荧光显微镜普遍采用。


    四、荧光显微镜的结构特点:


    荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。


    荧光光源——般采用超高压汞灯(50一200W),它可发出各种波长的光,但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长,所以需加用激发滤片(一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片),仅使一定波长的激发光透过照射到标本上,而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后,在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性,一般都比激发光弱,为能观察到专一的荧光,在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。它的作用有二:一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛,二是选择并让特异的荧光透过,表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。


    荧光显微镜就其光路来分有两种:


    1.透射式荧光显微镜:激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器,也可用普通集光器,调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上.这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强,而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱.所以对观察较大的标本材料较好。


    2.落射式荧光显微镜这是近代发展起来的新式荧光显微镜,与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面,即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器,它与光铀呈45。角,激发光被反射到物镜中,并聚集在样品上,样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜,反回到双色束分离器,使激发光和荧光分开,残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片/双色束分离器/阻断滤片的组合插块,可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀,成像清晰,放大倍数愈大荧光愈强。


    五、荧光显微镜使用方法.


    1.打开灯源,超高压汞灯要预热几分钟才能达到更亮点。


    2.透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片,在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片/双色束分离器/阻断滤片的插块。


    3.用低倍镜观察,根据不同型号荧光显微镜的调节装置,调整光源中心,使其位于整个照明光斑的中央。


    4.放置标本片,调焦后即可观察。使用中应注意:末装滤光片不要用眼直接观察,以免引起眼的损伤;用油镜观察标本时,必须用无荧光的特殊油镜;高压汞灯关闭后不能立即重新打开,需经5分钟后才能再启动,否则会不稳定,影响汞灯寿命。


    六、观察在示教台上的荧光显微镜下用蓝紫光滤光片,可见经o.01%的丫啶橙荧光染料染色的细胞,细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光(暗绿色和橙红色)。


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